535年，查士丁尼借口东哥特摄政王后爱玛拉森莎（Amalasuntha）被杀害的事件，发动了第一次与东哥特人的战争。贝利萨留率军在西西里登陆，逐步推进至意大利本土。536年，狄奥多拉皇后的亲信狄奥多西（Theodosius）被派往亚历山大任大主教，这一举动激起了埃及民众的强烈反抗。尽管反抗最终被镇压下去，但查士丁尼深刻认识到，继续对一性论教派采用高压手段可能会危及他的统治。因此，他采纳了皇后的意见，力图与一性论教派达成妥协，召回了被放逐的一性论教派主教，并设法调和一性派教徒与帝国政府、官方教会的矛盾。同年，贝利萨留成功攻占罗马，为东哥特战争的胜利奠定了基础。
537年，地中海沿岸地区出现了多个月的日光和月光被遮掩的现象，原因至今不明，可能是由于火山爆发引起的气候变化。这一现象导致了气候异常和农作物减产，给帝国的经济带来了负面影响。同年，圣索菲亚大教堂（Hagia Sophia）完工，成为拜占庭建筑的杰作，也是查士丁尼统治时期的重要象征。
539年，保加利亚人再次入侵希腊，大肆抢掠。查士丁尼不得不调集兵力应对这一新的威胁，进一步分散了他在其他战线上的军事力量。
六、内忧外患
540年，波斯再次入侵东罗马帝国，安条克（Antioch）被毁，这座城市在古代世界中具有重要的战略和经济地位，其被毁对帝国造成了巨大的冲击。查士丁尼被迫再次与波斯交涉，尽管他不惜以巨额赔款换取和平，但这种暂时的和平并未持久。541年，波斯军队再次从北方侵入拉齐卡地区（Lazica），查士丁尼不得不重新任命贝利萨留（Belisarius）指挥东方战场，进行一系列反击。尽管贝利萨留的军事才能再次得到验证，但帝国在东方的局势仍然十分紧张。
同年，一场致命的瘟疫从东方及中部非洲传至埃及，随后迅速蔓延至整个东罗马帝国。542年春天，瘟疫传至君士坦丁堡，这次大瘟疫被称为“查士丁尼瘟疫”。在君士坦丁堡，疫情迅速失控，大量人口死亡，社会秩序混乱。查士丁尼命令塞奥佐罗斯（Theodoros）负责处理尸体和救济病患，后来又下令在金角湾加拉大（Galata）挖深坑以掩埋尸体。这场瘟疫不仅夺去了无数生命，还严重影响了帝国的经济和军事实力。查士丁尼本人也一度染病，期间有军官策划政变。尽管这一阴谋因查士丁尼的康复而流产，但包括贝利萨留在内的一批文武官员仍遭到了牵连，进一步削弱了帝国的内部凝聚力。同年，查士丁尼废除了执政官这一从罗马共和国遗留下来的官职，可能出于节省开支的考虑。
544年，东哥特人在意大利发动起义，查士丁尼再次派贝利萨留赴意大利进行镇压。尽管贝利萨留最终成功平定了起义，但这一过程耗时耗力，进一步消耗了帝国的资源。548年6月28日，狄奥多拉皇后逝世，这对查士丁尼来说是一个巨大的打击。狄奥多拉不仅是他的妻子，也是他在政治和宗教事务上的重要顾问。她的离世使得查士丁尼在处理内政和宗教问题时失去了一个强有力的盟友。与此同时，皇位继承、巴尔干北方边界、宗教纷争等问题逐渐凸显，成为困扰查士丁尼后期统治的重要因素。
549年，一起针对查士丁尼的阴谋被破获，显示出帝国内部的不稳定和潜在的威胁。550年，查士丁尼派领贵族衔的利贝里乌斯（Liberius）率领舰队，以干预西哥特内政为名，占领了该国南部的部分国土。这一行动虽然取得了一定的成功，但具体年份仍有争议，有552年、554年等不同说法。
551年，地中海东部发生强烈地震，希腊地区的损失尤其严重。这场地震不仅造成了大量的人员伤亡和财产损失，还进一步加剧了帝国的经济负担。553年，为缓和基督教卡尔西顿正统派与一性派之间的矛盾，查士丁尼主持了二者的联合会，即第二次君士坦丁堡公会议。然而，会议最终变成了对基督一性论的批判，未能完全解决宗教纷争，反而加深了部分教派的对立。
554年，宦官纳尔西斯（Narses）在卡西利努姆战役中击败了入侵意大利的法兰克人，最终消灭了东哥特王国。为了指导意大利的重建，查士丁尼颁布了《国事诏书》（Pragmatica sanctio），就东哥特王国遗留下的法律的存废以及一些具体的法律问题作出规定。至该年，科西嘉、撒丁尼亚、巴利阿利群岛以及达尔马提亚等地，都已先后并入拜占廷版图，拜占廷帝国已囊括西罗马帝国除高卢、不列颠外大部分旧有领土，比它原有的领土面积几乎扩大了一倍。
然而，长期的对外战争消耗了国家的大量军事和经济实力，查士丁尼一世的继承人最终也未能制止斯拉夫人、保加尔人、匈人残部和阿瓦尔人的不断入侵。
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