从1594年起，在爱尔兰还爆发了一场为期九年的战争。尽管如此，伊丽莎白政府的政策保证了英国的安全，最大限度地节省了国家财力，减轻了人民负担，从而维护了社会稳定。
随着资本主义的成长，王权与资产阶级的联盟也开始出现裂痕，议会与女王的关系趋于紧张。这种矛盾首先表现在宗教问题上。资产阶级要求深入宗教改革，用清教代替国教，为此掀起了清教运动。伊丽莎白却以国教为统治工具，害怕清教的民主共和精神。1588年以后，随着天主教复辟威胁的消失，伊丽莎白加紧了对清教的打击和迫害。尤其是她晚年，多次处死清教激进派领袖，引起了资产阶级和议会的不满。其次，伊丽莎白在晚年越来越随意地把许多商品的专卖权赐给宠臣，严重损害了资产阶级的利益，也引起群众的不满。1597年议会请求废除专卖权，遭到女王拒绝。1601年，女王的最后一次议会再度讨论废除专买权的议案，对专卖权制度进行猛烈抨击。圆滑老练的伊丽莎白害怕与议会发生公开冲突，只好许诺停止出售有害的专卖权，还亲往议会进行安抚，使事态暂时得以平息。
同年11月30日，伊丽莎白一世在白厅向下院议员们发表了着名的“黄金演说”，大意是：“世界上原本没有无价之宝，无论多么贵重的珍宝，都比不上我提到的一个，这就是你们的爱。”她还在演说中说：“也许你们会见证许多比我英明的王公端坐于这个席位上，不过不会有比我还爱你们的人就座于此，这样的人过去没有，将来也不会有。”这是女王的最后一次公开演说。
此时，下层社会的动荡，资产阶级的不满，日益尖锐的宗教争端以及不断发生的宫廷倾轧，都使伊丽莎白晚年变得忧郁、孤僻、多疑。伊丽莎白一世在其辉煌的建树之后，给后人留下了少得可怜的财富和庞大的债务。与此同时，她的身体也变得衰弱多病。埃塞克斯死后，伊丽莎白患上了神经衰弱症，还有风湿病及慢性黄疽缠身。
1603年元月，伊丽莎白卧床不起。3月23日，已经病危且失去语言能力的她同意枢密院的安排，用手势指定苏格兰的詹姆斯六世继承王位。3月24日凌晨，昏迷中的伊丽莎白在萨里郡的列治文宫（曾名里士满宫）逝世，终年69岁。威廉·康登在《大英编年史》中有如下诗体记载当时伊丽莎白的臣民为她送葬时的情景：“女王由水路被运送到了怀特霍尔宫，船桨的每一次划动都令人眼泪汪汪；水下的鱼儿也纷纷地贴着船儿转，哭得眼珠儿掉落，盲目地跟着游动。”
由于伊丽莎白终身未婚且没有子嗣，故而在她死后，历经118年的都铎王朝的统治宣告终结。她死后由苏格兰的詹姆斯六世继承英格兰王位，称詹姆斯一世，开启了英国的斯图亚特王朝。
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